التعبير الجيني للانزيم البشري المركب Glucocerebrosidase في دوار الشمس

الملخص

تعد الزراعة الجزيئية واحدة من أهم تجارب التقنيه الحيويه لانتاج محاصيل نباتية معدلة وراثيا لإنتاج بروتينات طبية وان بكتريا Agrobacterium واحدة من أدوات الهندسة الوراثية التي تستخدم لادخال الجينات المرغوبه داخل النبات. في السنوات الأخيرة زادت الحاجه لإنتاج بروتينات علاجيه بطرق الهندسة الوراثية، ويعد انزيم الــ Glucocerebrosidase المستخدم  لعلاج المرض الوراثي Gaucher disease  واحد من تلك البروتينات. في الدراسة الحاليه تم تصميم بادئات خاصة لتضخيم  الجين البشري Hu-GBA1 المسؤل عن انتاج انزيم Glucocerebrosidase  من البلازميد المركب pGEM-GBA بعدها تم كلونه الجين المضخم في ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1304 للحصول على ناقل كلونة يحمل الصفه الوراثيه لتشفير انزيم Glucocerebrosidase. استخدام البلازميد المركب الناتج pCAMBIA1304-GBA لتحويل بكتريا Agrobacterium tumefaciens LBA4404  الى بكتريا حامله للبلازميد المركب. اكدت النتائج الحصول على بكتريا محورة وراثيا حامله للجين البشري  GBA1 بواسطة PCR Colony . علقت بكتريا Agrobacterium المحوره في وسط Infection Medium (IM) الحاوي على200 ميليمولارمن acetosyringone  واستخدم هذا العالق لتحويل فلقات نبات دوار الشمس الى فلقات محورة وراثيا حاوية على الجين البشري GBA1 ، اذ نميت الفلقات الحاوية على العالق البكتيري في الوسط الزرعي (Co-Cultivation Medium CCM) الخالي من المضادات مع 200 ميليمولارمن acetosyringone ، بعد ذلك تم نقل الفلقات إلى وسط اختيار( Selection Medium SM)) يحتوي على 7.5 مليغرام / لتر من Hygromycin و 250 مليغرام / لترمن  Cefotaximeوالتي نميت لمدة 14 يومًا إضافية بدرجه حرارة25م⁰  لفترة 16 ساعة ضوء و8 ظلام  .اذ تم بنجاح إستزراع  نبات دوار الشمس من الفلقات المحور وراثيا وقد ثبت وجود الجين 1Hu-GBA في الحمض النووي للنبات المحور النامي  بواسطه   PCR حيث كانت نتيجة التظخيم  حزمة بقياس 1561زوج قاعدي. كما تم الكشف عن التعبير الجيني للـ  GBA1في دوار الشمس المحور بواسطة الريال تايم  PCR مقارنه معGBA1gene  القياسي. استخدم الاختبار المناعي المرتبط بلانزيم ELISA وباستخدام عدة المحاليل الجاهزة (Human Glucosylceramide ELISA Kit) لتحديد هوية الانزيم المنتج من البروتين الخام المستخلصه من النبات المحور وتحديد تركيزه ايضا، حيث اوضحت النتائج ان تركيز انزيم glucocerebrosidase المستخلص من نبات دوار الشمس المحول بجين GBA1 هو0.45  نانوغرام/ مليلتر